Miksi western blotia käytetään elisan vahvistamiseen? + Esimerkki

Miksi western blotia käytetään elisan vahvistamiseen? + Esimerkki
Anonim

Vastaus:

Tyypillisesti tämä on vasta-aineen spesifisyystesti.

Selitys:

ELISA: ssa on hyvin vaikeaa kertoa, onko vasta-aine sitoutunut kiinnostavaan proteiiniin, täysin eri proteiiniin tai proteiinivalikoimaan.

Western-blottia käytetään vasta-aineen spesifisyyden tarkistamiseen (huomaa, että Western blot ei välttämättä tunnista kaikkia ristireaktioita virheellisten proteiinien kanssa).

Western blotissa näet sen proteiinin koon, johon vasta-aine on sitova (et voi ELISA: ssa). Siksi esimerkiksi, jos vasta-aineen pitäisi olla sitoutunut 56 kDa: n proteiiniin ja sinä näet blotissa ~ 56 kDa: n kaistan, voit olla kohtuullisen varma siitä, että vasta-aine sitoutuu oikeaan proteiiniin.

Jos toisaalta näet 32 kDa: n kaistan, voitte päätellä, että vasta-aine on sitoutunut väärään proteiiniin. Samoin, jos useat bändit näkyvät Western blotissa, niin se viittaisi (proteiinien hajoamisen puuttuessa), että vasta-aine oli sitoutunut useisiin erilaisiin proteiineihin.

Esimerkissä geelissä esiintyvästä 32 kDa: n kaistasta ja myös useista kaistoista, se viittaisi siihen, että vasta-aineella ei ole spesifisyyttä ELISA: lle ja että kaikki ELISA: ssa havaitut tulokset eivät välttämättä ole spesifisiä mielenkiinnon kohteena olevalle proteiinille.

Jos käytettäisiin tällaista testiä I, siihen voi sisältyä jonkinlainen "häiritsevä" reagenssi vasta-aineen testaamiseksi. Esimerkiksi, jos olisin nostanut vasta-aineeni peptidiin I, se voi sisältää primaarisen vasta-aineen liuoksen peptidin oikean sitoutumisen testaamiseksi. Toisin sanoen, peptidin läsnäollessa minun ei pitäisi nähdä yhtään yhtään tulosta ELISA-testistä, koska primaarinen vasta-aineeni ei kykene sitoutumaan peptidin ylimäärän vuoksi.